B12-vitamiinin puutetta epäiltäessä ensisijaisena tutkimuksena suositellaan aktiivisen B12-vitamiinin eli ns. transkobalamiiniin sitoutuneen B12-vitamiinin (S-B12-TC2) pitoisuuden määrittämistä seerumista. Aktiivisen osuuden määritys (B12-TC2) on parempi kuin B12-vitamiinin kokonaispitoisuuden määritys.

B12-vitamiinin tärkeimpiä lähteitä ovat maksa sekä liha- ja maitotuotteet. Kun mahalaukku on kunnossa sen solut valmistavat ns. sisäistä tekijää, johon sitoutuneena B12-vitamiini kykenee imeytymään ohutsuolesta. B12-vitamiinin puute on yleistä yli 65-vuotiailla imeytymisongelmista johtuen. Puutetta voi aiheuttaa myös tiukka kasvisruokavalio ja jotkin lääkkeet. Hoitamattomana B12-vitamiinin puute aiheuttaa anemiaa, jossa punasolujen keskitilavuus (MCV) on suurentunut. Tyypillisesti ilmenee myös hermoston oireita, kuten tunnon häiriöitä, lihasheikkoutta tai muistin häiriöitä. Kun aktiivisen B12-vitamiinin pitoisuus on alle 20 pmol/l, tulos viittaa vahvasti B12-vitamiinin puutokseen. Jos pitoisuus on yli 50 (-75) pmol/l, B12-vitamiinin puutos on suljettu pois. Raja-alueella puutos on mahdollinen. Tällöin on harkittava lisälaboratoriotutkimuksina homokysteiinin tai metyylimalonaatin määrityksiä. Vaihtoehtona on aloittaa hoitokoe B12-vitamiinilla ja seurata, onko sillä vaikutusta. B12-vitamiinihoidossa olevilta ei yleensä ole tarpeen tarkistaa toistuvasti B12-vitamiiniarvoja. Hyvänä pysyvä hemoglobiinitaso on riittävä korvaushoidon onnistumisen mittari. Korkeilla B12-vitamiiniarvoilla ei ole käytännön merkitystä.